Kurzfassung
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Nutzung der MAD-Methode an der
Schwefel-K- und Phosphor-K Absorptionskante um die 5.0 und 5.7\AA zwecks
der Bestimmung der strukturellen Information an dem Molekül des
Riboflavin-bindenden Proteins (RfBP).
Durch das Variieren der Energie um die Absorptionskante des anomal
streuenden Atoms im Makromolekül, wird bei der Diffraktion
ein wellenlängenabhängiges Signal in der gemessenen Intensität
generiert, welches im Prinzip ermöglicht die Bestimmung der Phasen
der Strukturfaktoren.
Schwefel ist ein natürlicher Bestandteil vieler Proteine, und am Beispiel
von Lysozym konnte früher gezeigt werden, dass diese Atome
als mögliche Kandidaten für die Phasenbestimmung mit der Multiplen
Wellenlengen-Methode angesehen werden können.
Für die 5\AA-Diffraktometrie im Vakuum an einer unbekannten Struktur wie
RfBP waren einige technische Verbesserungen, insbesondere zur Minimalisierung der
Absorption aller instrumentellen Komponenten nötig.
Zur den Entwicklungen während der Arbeit zählte eine
Miniatur-Probenzelle, die die Kristallmontierung in einer Sauerstoff-freien
Atmosphäre ermöglicht.
Das optische System am Strahl A1 im HASYLAB wurde mit einer fokussierenden Kapillare
ausgestattet, mit welcher der 5\AA-Photonenfluss um den Factor 5 erhöht werden
konnte.
Gleichzeitig wurde damit die Genauigkeit der Bragg-Intensitätsmessung
erhöht, indem der Einfluss der Gitterstruktur des Detektorfensters vermindert
wurde. Die Fehlerabschätzung für diesen Effect wurde durchgeführt.
Ein Monitor-System wurde gebaut, das eine schnelle Justierung
der Kristallproben im Strahl ermöglicht. Für die Halterung der
Pulver-Proben im Strahl zwecks Aufnahme der Absorptionsspektren während der
kristallographischen Messungen wurde eine neue Konstruktion entwickelt.
Die Arbeit umfasste einen biochemischen Teil, in dem Cryo-Lösungen für die
RfBP-Kristalle gefunden wurden, mit deren Hilfe die ersten langwellige und auch neue
kurzwellige Datensätze gemessen werden konnten. Die Auflösung der
kurzwelligen Daten wurde damit von den früheren 3\AA auf 1.95\AA verbessert.
Zum ersten Mal seit der ersten einziger RfBP-Kristallisierung wurden wieder frische
RfBP-Kristalle gezüchtet.
Ausnutzung der nativen S-Atome, die in den 9 Disulfid-Brücken und 7 Methioninen
des RfBP-Moleküls eingebettet sind,
gewährleistet perfekte Isomorphie, welche in den herkömmlichen
Derivat-Methoden ein grösseres Problem darstellt.
Das Variieren der Röntgen-Wellenlänge um die
Schwefel-K-Absorptionskante
führt zu einem resonanten Signal, das für das RfBP-Molekül in der Grösse
von 4% liegt (berechnet mit Hilfe numerischer Methoden).
Parallel zu den 5\AA-Messungen wurden anomale Daten an RfBP-Kristallen (analog zu den
Messungen von Teeter und Hendrickson) mit den
Wellenlängen 1.0\AA und 1.7\AA durchgeführt, die quasi als Referenzdaten
zu den 5\AA-Daten dienten. Der strukturelle Inhalt der Patterson-Funktionen für
alle die gemessenen Daten erwies sich als vergleichbar.
Die langwelligen RfBP-Datensätze wurden by -40\circC an drei
Wellenlängepunkten um die Absorptionskante gemessen. Eine algebraische
Dispersionsanalyse
an den drei Datensätzen wurde durchgeführt, wobei die resultierenden Amplituden
der anomalen Strukturfaktoren weiterhin sowohl für die Patterson-Methoden wie
auch für die Direkten Methoden verwendet wurden.
Die daraus bestimmte Schwefel-Unterstruktur
des RfBP-Moleküls wurde weiterhin für die Phasenbestimmung
benutzt, wobei das anomale Problem als Multipler
Isomorpher Ersatz behandelt wurde. Die Analyse mit 35% kompletten Daten von einem Kristall
lieferte etwa 900 Phasen, die als statistisch korrekt angesehen werden können
(FOM >=q 55%, phasing power>=q 3.0, Cullis R =< 0.5). Die
mit S-Strukturfaktoren aus der Dispersionsanalyse berechneten Pattersonkarten
zeigten eine signifikante
Korrelation mit den mit 1.00 und 1.7\AA gemessenen. Diese Ergebnisse beruhen auf neu
entwickelten Programmen zur Datenanalyse, Skalierung, Formatierung und Phasenberechnung.
The aim of the present work was to make use of Multiwavelength Anomalous Diffraction (MAD) at the sulphur and phosphorus absorption K-edges around 5\AA and 5.7\AA respectively, for the determination of structure information on Riboflavin Binding Protein (RfBP). When varying the energy across the absorption edge of anomalously scattering atoms during diffraction experiments, an additional signal in the measured reflection intensities is generated, which in principle - when measured at least at two wavelengths - allows the phase of the structure factors to be determined. Sulphur atoms are an integral part of many proteins. On the example of the known structure of lysozyme, it has already been shown, that such atoms can serve as possible candidates for the phase determination by multiple wavelength methods. For diffractometry in vacuum at 5\AA further technical developments and minimizing of absorption of all instrumental components were necessary to realize the purpose of phasing an unknown structure. One of the achievements of the present work includes the design of a miniature sample cell in connection with a mounting system for enclosing the crystals in an oxygen free atmosphere under vacuum. Another was the addition of a focussing glass capillary as an optical element. With this capillary a gain in the 5\AA photon flux of up to a factor of 5 was achieved. Simultaneously it enhanced the accuracy of the measured Bragg intensities, which in the first lysozyme diffraction experiments appeared to strongly depend on shadows from the windows of the detector system. With a numerical model of the grid structure and an assumed reflection profile, the possible error magnitude of the measured integrated intensities has been estimated. A monitoring system was designed for the observation and optimal alignment of the crystal samples in the beam. The mounting construction for XANES samples was improved, making possible the registration of absorption spectra also in between the crystallographic measurements. For the RfBP crystals cryoconditions were found with which the first long (5.0\AA) and short (1.0\AA) wavelength RfBP cryodata could be obtained. The resolution limit of the latter was improved from previously 3\AA to 1.95\AA. For the first time since many years fresh RfBP crystals have again been grown, giving the possibility of solving the structure in the future. This work is an example of the crystallographic use of anomalous dispersion at the S K-edge which proves to be a competitor to the conventional methods of phase determination, i.e. which use Direct Methods in case of small molecules or Isomorphous (IR) or Molecular (MR) Replacement for macromolecules. Anomalous scattering of native S labels embedded in 9 disulphide bridges and 7 methionines of RfBP, ensures perfect isomorphism, not so easily obtained by IR methods. Variation of the anomalous signal when varying the wavelength in the vicinity of the absorption edge of sulphur, gives rise to the resonant basic scattering function magnitudes of 4% (sulphur MAD signal predicted as fraction of total scattering). Also the minute RfBP anomalous signal at 1.00\AA and 1.7\AA has been used (in a way similar to Teeter and Hendrickson) as an instant parallel check between the short and long wavelength data. The resulting Patterson structural details appeared to compare quite well. Data sets of native RfBP crystals at -40\circC at three wavelength points around 5\AA have been measured. An algebraic formalism on three wavelength points has been applied and the resulting magnitudes of the anomalous structure factors were used both for Patterson search and for direct methods attempts. The tentative partial S RfBP structure was used for further phasing approaches of the long wavelength measurements, treating the anomalous problem as a multiple isomorphous replacement(MIR). The analysis of the 35% complete data from one crystal revealed phases that match the standard criteria for statistical correctness (FOM >=q 55%, phasing power>=q 3.0, Cullis R =< 0.5). Patterson maps of the calculated S structure factors from the dispersion analysis show a significant correlation with the anomalous native Patterson maps of the complete short wavelength data with 1.95\AA resolution. In order to achieve these results some new data processing programs for scaling and data formatting, phase determination and comparison had to be developed.